EO516_marzo_2024

T&M POWER SUPPLIES Questo processo comprende diverse fasi, ma tre sono le più critiche (denaturazione, ricottura, estensione) e ven- gono ripetute più volte per creare copie dei segmenti di DNA (Fig. 3). Senza entrare troppo nei dettagli, possiamo riassumere le tre fasi critiche qui di seguito: Fase uno – Denaturazione Il preparato contenuto nella provetta viene riscaldato ad almeno 94 °C. Il calore rompe i legami idrogeno del cam- pione di DNA originale e separa il DNA in filamenti sin- goli. Fase due – Ricottura La temperatura viene abbassata a circa 5 °C al di sotto della temperatura di fusione dei primer, tra 50 e 60 °C, consentendo ai primer del DNA e all’enzima DNA poli- merasi di legarsi ai singoli filamenti di DNA separati dal calore. A questo punto, i nucleotidi (A, T, C, G) della solu- zione di miscela aggiunta si accoppieranno con i singoli filamenti di DNA separati dal processo di riscaldamento. Fase tre – Estensione La temperatura viene quindi aumentata fino a 72 °C per avviare il processo di estensione. Una volta uniti, i seg- menti formano un nuovo filamento complementare di DNA. Da ciascuno dei singoli filamenti della molecola originale del campione si è formata una nuova molecola di DNA duplicata a doppio filamento. Una volta comple- tata la sequenza, la temperatura viene aumentata per av- viare un nuovo ciclo. Le fasi da uno a tre vengono quindi ripetute per cir- ca 30-40 volte, ripetendo automaticamente i cicli di ri- scaldamento e raffreddamento del processo, in modo da raddoppiare la sequenza di DNA a ogni ciclo di riscalda- mento/raffreddamento. Alla fine del processo si ottengo- no milioni di copie del campione originale. Fase quattro – Estensione e conservazione finale Per consentire la corretta sintesi di tutti i prodotti di PCR è necessaria una fase finale di estensione, di solito a 72 °C per 10 minuti. Infine, la temperatura deve essere ridotta a 4 °C per conservare il prodotto di PCR fino all’analisi. A seconda dell’obiettivo finale, del tempo o del livello di precisione richiesto, vengono spesso utilizzate varianti di questo processo, come ad esempio la PCR quantitati- va in tempo reale (qPCR), la PCR a trascrizione inversa (RT-PCR), la PCR a trascrizione inversa-quantitativa (RT- qPCR), la PCR digitale (dPRC) e la PCR digitale a gocce (ddPCR), la PCR a microfluido. Alimentatori per una PCR efficiente Esistono molte applicazioni mediche che richiedono un controllo termico, ad esempio incubatrici neonatali, ri- scaldamento del sangue per l’emolisi, camere di incuba- zione di laboratorio e così via. La maggior parte di queste applicazioni richiede una regolazione termica accurata e la maggior parte degli alimentatori medicali con control- lo della tensione di uscita sono adatti a tali applicazioni. Fig. 3 – Cicli e durate della PCR (Fonte: PRBX) Fig. 4 – Tipica attrezzatura da laboratorio per la PCR (Fonte: PRBX/ Natatravel/Shutterstock) ELETTRONICA OGGI 516 - MARZO 2024 63